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自动化细胞洗涤和浓缩技术的进展

作者:尊龙app人生就是博   来源:  时间:2022-06-21 11:12  点击:

  细胞疗法的成功商业化需要对产品质量、成本和制?造过程的规模进“行全面规划和?考虑。自动化的;实施对?于工业化规模的稳健且可重复的;制造过程至关重要。已经开发了许多用于细胞制造的洗涤和浓!缩装置。这些技术源自输血医学、造血“干细胞和生物制剂制造,其中操作机:制与手:动离心不同。

  这篇综述描述了每个当前可用的洗涤和浓缩设备的历史起源和基础技术,以及它们在细胞、治疗应用。中的:相对优势和劣势。了解这些技术的特定属性和局限性对于优化细胞疗法制造至关重:要。

  在决定使用洗涤和浓缩设备?时,有几个重要的考虑因素。这些在表 1 ;中进行总。结。

  在选择洗涤和浓:缩设备时,任何给定制造过程的具体要求都将影响决策过程。洗涤和”浓缩步骤可以在,制造过程开始时应用,用于细?胞富集。也可用于培养基更换过程的中间或过程结束时浓缩细胞悬液用于产品配制和填充。除了工艺开发步骤中的考虑因素外,设备还应解决产品的关键质量属性,例如“细胞数量、活力和细胞浓度。鉴于自!体和异体产品的加。工,要求不同,设备选择的考虑因素也不同。

  最小处理能力和回收的活细胞百分比是自体产品特别重要的因素,因为细胞回收率低可能导致生产运行失败。当需要浓缩的细胞?悬浮液时,最小输出量也可能是一个关键因素。

  用单采材料制造 ATMP 通常需要去除红细、胞 (RBC) 或选择细胞。除了缓冲液交换外,一些处理设备(例;如 Se;pax、Lovo、Elutra !和 Rotea)还能够去除红细胞。

  通常,人们会选择一种能够在制造过程中执行多个步骤的设备,而不是拥有两个独立的设备,从而最大限度地提高资本投资并最大限度地降低工艺开发成本。

  在选择用于处理同种异体产品的设备时,最大处理能力?是一个重要因素。这通常称为起始材料的输入体积范围。目前市场上可用的洗涤和浓缩设备的输入。体积范围如图 1 所示。同种异体产品的输入体;积范围从小于50mL(例如脐带血)到1000 L或更多 扩大细胞培养。

  影响洗涤和;浓缩设备选择的另一个关键因素是处理速率和时间。当细胞在下游设备中长、时间处理时,对细胞质量(例如剪切应力)的任何负面影响都会被放大,下游设备通常没有温度或pH控制。此外,受到压力因素、(如转染、转导、酶消化或细胞选择)的细胞可能对洗涤和浓缩引起的压力更加敏。感。

  自动洗涤和浓缩设备通常作为加工链的一部分运行;因此,必须事先评、估将设备集成到工艺链中。物理集成是指设备如何适应处理链并连接到其他设备。当细胞以封闭方式转移时,自动化的价值最大化;因此,规划和评估设备如何相互连接非常、重要。

  如果试剂;(?例如,培养基、冷冻保存剂或缓冲液);已包含在袋子中,则设置洗涤和浓缩装置可能很简单。袋子是几乎所有处理设备都支持的格式。如果管道尺寸兼容,它们可以通:过尖刺端口或无菌焊接连接。如果:不这样做,则需要在与洗涤和浓缩装置进行无菌连接之前将材料装入转移袋的额外步骤。如果这种转移不能通过无菌连接实现,那么自动化的价值就会大大降低,因为它被认:为是一个开放的过程。

  理想情况下,浓缩产。品也应以封闭方式转移到下游过程(例如灌装和配制)。由于洁净室空间通常有限,因此还应考虑设备的占地面积和移动性。设备。的便携性是有利的,允许在房间之间运输而无需重新校准。如果设备不便携,重要的是要考虑重新校准的复杂性。

  软件集成对封闭化自动化的细胞工艺非常重要。用集中的电子批次记录代替手动批次制造和质量控制记录,可以实现操作自动化。此外,软件集成可以扩展到集中系统上的多个设备,它可以控制所有链接的设备并提供实时反馈。这种方法在生物制剂的制造中很常见。

  工艺开发的目标是?开发一种稳健、可重复的工艺,该工艺可以在保持产品质量和满足监管要求的同时进行临床生产。稳健的;洗涤和浓缩工艺是一种无论输入材料如何变化都具有最小故障率的工艺。实现这一目标涉及仔细的设备选择和彻底优化的协议。可重复的过程是产生,可预测结果的过程。

  理想情况下,开发的流程?还应,考虑商品、成本,以确保产“品在:进入;市场时有利可图。商品成本通常是指产生的制造成本,例如!原材料、劳动力和质量控制测试。ATMP开发过程中产生的其他成本包括临床试验、监管批准和营销的成本。购买洗涤和浓缩设备、一次性处理套件和持续维护的资本投资是与实施、自动化相关的一些“明显成本。直接比较不同洗涤和浓缩设备的资本投资和消耗品成本可能有助于制定技术的决策。

  用于?洗涤:和浓缩细胞的常规离心方法是开放过程。或者,样品可以在细胞转移袋中离心以实现封闭处理。这种封闭:处理的手动方法简单且具有成本效益,并且在骨髓移“植中很!常见,因为在冷冻保存前进行单采单位的体积减少。在这种情况下,细胞转移袋无菌焊接到另一个转移袋,在离心过程中手动夹住连?接管。离心后,将含有细胞的转移袋置于血浆提取器上,在松开手:动夹钳后,将多余的缓冲液或:血浆轻轻压入新袋中。

  一个这样的例子是AutoXpress平台系统(ThermoGenesis Corp.),它是一种脐带血/干细胞处理系统(图 2)。它由装置和一次性。处理套件组!成。处理套件包含多个小口袋,用于存储分离的血浆、单核细胞和红细胞(图 2A)。脐带、血样本:首先转移到处理套件中,然后安装到、设备“中,(图“ 2B)。然后将该装置装入,离心桶。中并离心以将样品分“离成血浆、血沉棕黄层和红。细!胞层。该设备通过改变旋塞手柄的位置将红细胞自动引导到各自的收集袋中(图 2C)。然后:将血沉棕黄层引导至采样袋和冷冻保存袋。之后手动添加冷冻保护剂。该技术也可用于培养细胞(X-WASH 系统.)。

  基于离:心的技术是应用最广泛的分离方法之一。基于离心的设备具有不同的形状和配置。已应用于细胞疗法的大多是管状碗型[34]。尽管管状碗装置的细”胞分离机制相似,但它们依赖不同的机制来:输送细胞浓缩物。

  COBE 2991 (Terumo BCT) 是由IBM工程师团队于1972年开发的。这项工作是由工、程师乔治 T.贾德森发起的,他17岁的儿子被诊断出患有白血病,并被马里兰州贝塞斯,达的国家癌症研究所:录取。当贾德森参观国家癌症研究。所的血库、时,他看到了如何离心分离白细胞以分离白细胞。这激发了两种独特设备的开发:IBM 血细胞分离器和 IBM 血细胞处理器。IBM的医疗部门后来于1984年被Cobe Laboratories收购,这些设备现在以COBE Spectra白细胞分离系统和COBE 2991细胞处理器销售。

  最终设计如图 3 所示,该图”展示了血液或白细胞去除术产品通过中央端口进入甜甜圈形处理袋:的位置。离心后,细胞和培养基:垂直分离,细胞向处理袋的外围迁移。然后液压液体使离心碗内的柔性膜膨胀,压在细胞处理袋上,从而将上清液从处理袋“的中心排出。

  迄今为!止,COBE 2991的使用在很大程度上仅限于最。少操作的细胞产品,这可!能部”分是由于可扩展性有限。

  Cell Saver(Haemonetics)是 1974 年推出的第一个商业血液回收装置。这些设”备旨?在收集血液、用生理盐水“代替血浆并浓缩红细:胞以进行再”输注。这个过程是通?过钟形离心室(碗)实现的,其中形成:离心力梯度,使红细胞向离心室的底部和侧面沉积(图 4A)。一旦红细胞被?浓缩和洗涤,细胞就会通过反转泵的方向并用过滤的清洁空气更换腔室来输送。

  有几种血液回收装置能够按照类似的原理实现细胞清洗和浓缩,包括 E“lect?a(Sorin Group,Saluggi“a,意大利)、CATS(Fresenius Kabi,Bad Homburg,德国)和 OrthoPAT(H,aemonetics)。一项研究调查了使用 Cell Saver 5 从单采产品中分离单核细胞的情况,实现了大约 90% 的 RBC 去除率和大约 64% 的单核细胞回收率 [54]。将该设备应用于ATMP制造的一个可能挑战是产量相对较大,可能不适用于某些自体产品。

  在“80年、代后期,探索了使用脐带血作为骨!髓重建造血干细胞的替代来源的可行性。每个脐带血单位(50-200 毫升)减少到大约 20 毫升的标准体积。自动化和:标准化?此过”程的需要:导致了多种自动化处理设备的开发,例如前面提到;的AutoXpress平台,以及最近来自 BioSaf“e Systems的Sepax(后来由Cytiva 销售)。

  Sep。ax 2 是一种用于脐带血处理的医疗设备,而具有类似设计的 Sepa、x C-Pro是一种细胞制造设备。Sepax 是一种封闭式自动化处理台式设备,设计用于处理脐带血、骨髓和类似的起始材料。它使用类似注射器的圆柱形筒进行细胞浓缩和洗涤。在其自动细胞分离协议中,处理室首先绘制密度梯度缓冲区(图 4B)。密度梯度介质的密度通常约为、1.077g/mL,这允许红细胞沉降(密;度约为1.11 g/mL),同时将单核细胞“(密度约? 1.067–1.077 g/mL)保持在悬浮液中。随后,血样:被吸入腔!室,同时?腔室从底,部离,心。单核细胞和红细胞通过密度?差和离心垂直分离。注射器缓慢排出分离的层,这导致血浆分离,然后是单核细胞、部分。位于设。备顶部的光学传感器检测,通过的内容物,并通过控制旋塞歧管将它们导入预先指定的袋子。

  该公司还开发了一种更全面的设备版本,即 Sefia(图 4D),它使用与 Sepax 相同;的核心技术。Sefia 可以通过连续流技术处理大于 10 L 的体积(表 2)。

  CARR UniFuge是一个连续处理系统,容量1000-L(图4E)。CARR UniFuge的工作原理与Sefi。a系统的工作原理相似,都依赖?于离心筒。细胞聚集在圆柱体周围内壁,而上清液通过圆柱体的;中心,类似于 Cell Saver 使用的机制。主要区别在于溢出的浓缩细胞通过与流体分离的通道连续收集,从而实现连续处理。CARR UniFuge Pilot 是该系列中最小的版本,气缸室“容积?为 1.7 L。这种最小的输入”容积可能”使其不适“合早期工:艺开发。该公司已提议发布具有较小腔室尺寸 (275 mL) 的缩小版本,以满足早期、开发需求 。

  逆流离心装置的最初概念和设计可以追溯到1932年,当时Charles Lindbergh 设计了一种装置来洗涤悬浮的红细胞。1948年,Lindahl报道“了使用逆流离心系统成功分离细胞。此后,贝克曼仪器公司进一步开发并销售了该技术,用于细胞分离。Beckman设计包括一个专门的离“心机(:Ava:nt、i J-26 系列和 J6-MI),配有一个淘洗转子 (JE-5.0),允许安装管道和分离室(图 5)。

  腔室;的大小决定了最大和最小的处理能力。表 3总结了各种逆流离心装置的腔;室尺寸和稳定流化细胞床所需的最小细胞数。流化床的形成需要腔室内的临界数量的细胞,其中细胞的碰撞最小“化由进入的细胞引起的旋转效应。流化床的稳定性随着细胞数量的增加而增加 。Rotea 等设备配备有摄像头,可实时评估腔室内的?细胞床稳定性,这有助于:流程优化。

  Elutra和K!sep系列具有类似的腔室设计,其中细胞入口位。于从窄端连接、的腔室外部(图 6A)。Ro!te;a腔室设计:的不同之处在于细胞入口在腔室内(图 6B),这允许更高的离心速度(表 3)并最大限度地减少死区。更高的离。心速度也;是有益的,因为它:允许细胞以更高的流速和效率在腔室中积聚。

  尽管逆流离心技术有这些有前途的方面,但关于这种方法在细胞洗涤和浓缩方面的效率的信息仍然很少。最近的一项研究报告称,Ksep 400在2小时内对50 L多能干细胞进行了洗涤和?浓缩过程,实现了90%!以上的:细胞回收率,并且对细胞活力“没有负面影!响。另一方面,Rotea能够清!洗和浓缩体积?小于50 mL的样,品。该研、究报告称,处理时?间不到15分钟,细胞回、收率接?近100%,而细胞!活力没有损,失。这些研!究举例。说明、了逆流离心装置的大操作范围,这是从早期,临床研究进展到商业生产的;理想选择。

  过滤使用尺寸排阻过程通过多孔结构(过滤器)保留较大的颗粒,同时允许较小的!颗粒通过。过滤已应用于广泛的行业,包括食品、材料、和药品制造。制药行业常用的过滤方法有三种:常流过滤(NFF)、切向流过滤(TFF。)和旋转膜过滤。

  NFF也称为死端过滤,是最基本!的“过滤形式,其中输入材料从过滤器的一侧传递到另一侧(图 7A)。NFF是一种经济高效的方法,用于在滤液含有目标产品的生物制造中去除细胞或细胞碎片。当样:品中固体含“量的百分比较低时,这种技术最有效,因为高固体含量会导致膜堵塞(结垢)。对于细胞治疗应用,NFF最常用于收获间充质基质细胞 (MSC),以在酶解后从细胞中分离微!载体。

  TFF是一种动态过滤技术,其中输入材料以平行流进料到过滤膜,从而最大限度地减少膜污染”(图 !7B)。一项使用TFF进行MSC收获的研究表明,优化后的细胞回收率超过80%。Kaneka细胞浓缩清洗系统是为细胞制造开发的最新 TFF 设备之一。它具有附加功能,例如用于酶消化的中间袋和可编程;流体路径,这使其成为脂肪组织来源的 MSC 处理的理想选择。

  T“FF系统的问!题之一是膜盒系统内可能发生跨膜压力的变;化,这可能会导致破坏性剪切力。交替切向流 (ATF) 系统是TFF的一种变体,已在细胞采集中广受欢迎。ATF系统不像TFF那样使用单向流动,而是允许流体在中空纤维膜上来回流动,从而提高效率。商业ATF系统的一个例子是XCell ATF,它能够从1 :L放大到2000 L(表 4)。

  纺丝过滤膜系统包括容器内的圆柱形!膜。输入材料“装入容器和膜之间的环形间隙中。两个同心旋转圆!柱体间隙内的流体动力学被描述为 Couette 流。值得注意的是,当内圆柱体的旋转达到阈值速度时,会产生称为泰勒涡流的环形涡流 。然后通过环形间隙中的膜旋转形成泰勒涡流来促进过滤(图 7C)。

  第一个商用旋转膜过滤装置是Biodruckfilter(Sulzer)和 Benchmark旋转生物过滤装置(Membrex Inc),它们是为生物技术行业开发的。这两种设备都不是可扩展的,因为它们包括单个圆柱体“并且过滤面积限、于圆柱体的壁。随后通过使用多盘或多轴设置最大化过,滤面积来实现扩大旋转膜过滤系统的后续开发。尽管如此,单缸设计仍然是血浆置换和“细胞治疗制造的中”流砥柱。

  在1980年代,多孔中空纤维血浆过滤被提出作为血浆置换离心系统的一种更简单、更便宜的替、代方法。然而,由于血小板和红细胞积聚以、及膜污。染导致渗透压增加,中空纤维过滤效率通常较低。1985年引入了基于旋转膜的血浆!置换术,大大提高了血浆收集的效率。该技术随后被 Baxter 商业化,并开发成一种自动化细胞洗涤和浓缩设备Cytomate(2010年停产)。

  此后,这项技术以Lovo的形式进“一步发展,这是一种旋转膜洗涤和浓缩装置,能够在不到30分钟的时;间内处理 500 ”毫升的材料。Lovo能够执行RBC和免疫磁珠去除、缓冲液。交换;和体积减少。值得注意的是,Lovo的最小输出体积为;50 m:L,这对于输入体积小于100 mL的应用可能并不理想(表 4)。

  超、声波技术的!现代应用始于、1917年的潜艇探测。后来发现超声波、可用”于医学“成像、食品加工、废水处理和生物加工。超声波能够根据颗粒的密度分离颗粒,因为密度较高的颗粒倾向、于在超声波场中向压力节点移动,而密度较低的颗粒向压力波腹移动(图 8A)。将粒子推向压力节点的力是主要的声学力,它导致粒子在声场中积聚并形成带。具有较大半径的颗粒在给定的颗粒密度下具有较高的初级声学力,然后允许进一步分离颗粒。次级声力施“加在粒子带内,根据两个粒子的中心线与波的方向之间的角度,驱动粒子彼此靠近或远,离。当角度介于54°和90°之间时,颗粒会相互吸引(“图 “8B),形成团簇,最终从悬浮液中沉淀出来(图; 8C)。

  自1990年代以来,已经开发了许多基于声学的细胞分;离装置。换能器用于在一侧产生宏观超声波,在另一侧反射以产生声波场。当声力达到临。界强度时,细胞或颗粒被困在驻波中,形成堆积的簇,然后沉淀。当起始材料具有相对较高的细胞密度或涉!及大细胞时,基于声学的细胞分离最有效,因为细胞簇的形成是沉淀的关键。

  BioSep设计为灌注培养系统的一部分,用于“悬浮、细胞和,进行培。养基交换。因此,这些系统中的处理速率相对较低。Cadence 声学分离器专为细胞收。集和培养基澄清而开发,最大处理速度为:3.6 L/h(表 3)。该系。统的一个缺点是它以 2×10 7 个细胞/mL 的最小输入细胞密度运行,这远高于细胞制造扩增结束时的典型培养密度。

  Ekko是一种新开发的细胞处!理设备,它克服了传统声学设备的一些”问题。Ekk,o系统具”有独、特的腔!室设计,其中细胞通过两侧的流体入口进入并、向上移动。然后,细胞受到由专有压电装置产生的多!维声驻波的影响。腔室设计通过结合重力、流体阻力以及初级;和次级声力使细胞聚集最大化,从而允许“捕获”低密度细。胞,例如淋巴,细胞。同样的设:备也正在开发用?于细?胞选择和灌注培养协议的培养基交换。

  尽管有多种洗涤和浓缩设备可供寻求自动化这一步制造过程的用户使用,但制造需求与可用技术之间仍然存在重大差距。根据一些最近批准的产品的规格,大多数洗涤和浓缩设备可以提供所需的细胞浓度和体积范围。尽管如此,儿科!适应症可能需要低至1.2×10 6 个细胞的剂量,这远低于目前可用的洗涤和浓缩设备的操作范围。

  一般来说,新一代洗涤浓缩设备更受欢迎,因为它们占用空间更小、易于使用和软件支持。重要的?是要记住,过程开发需要大量的努力。Sepax和Sefia等设备是基于离心的系统,其处理参数类似于台式离心机系统。因此,流程开发更、加直观,非常适合经验不足的团队。Lovo系统可能”有利于儿科应用,在这些应用中需要去除DMSO,而且细胞数量有时很少。Ekko系统最适合处理具有高声学对比度(例如,微载体)和高细胞密度(例如,单采单;元)的材!料。Rotea系统在自动化编程方面具、有、很大的灵活“性,这对、希望根据自己的需求定制流程的人很有吸引力(例如,类器官处理或将细胞浓缩至300×106个细胞/mL)。

  鉴于已经开发了一系列洗涤和浓缩设备,该领域的未来发展可能会以更灵活和定”制的处理套件的形式出现,而不是开发新型设备。预计未来的发展也将鼓励治疗开发商和行业合作伙伴之间加强合作,以在细胞制造方面提出创新解决方案。

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